Stereo-seq应用专题：用“生命全景照相机”解码生命奥秘 时空简讯45期
GraphST可以将scRNA-seq衍生的样本表型转移到空间转录组上，这一点通过描绘肿瘤来源的组织切片中肿瘤和正常相邻区域得到了证明。
时空转录组技术是近年来发展迅猛的新兴技术，它不仅仅可以定量检测细胞的基因表达，还能精确定位细胞在组织中的空间位置，实现了从时间、空间维度深度解析健康和疾病状态下细胞类型和基因表达的变化过程。2020年，华大自主研发出超高分辨率的“生命全景照相机”Stereo-seq（Spatial Enhanced REsolution Omics-sequencing），该技术基于DNA纳米球测序芯片，实现了500 nm的分辨率，同时捕获面积可达13 cm×13 cm。
目前，Stereo-seq已被成功应用到胚胎和器官发育、再生医学、肿瘤研究等多个领域，相关成果分别以专题和封面文章形式发表在CNS及其子刊，并入选了中国科协生命科学学会联合体评选的2022年度“中国生命科学十大进展”和GPB评选的2022年度“中国生物信息学十大进展”。在此，就Stereo-seq在生长发育、疾病研究、工具研发领域发表的10篇文章进行简述，以供参考。后续也将推出有关Stereo-seq技术及其应用文章的简讯，敬请关注。
① 蝾螈具有非凡的脑损伤再生能力，应用Stereo-seq首次构建了蝾螈端脑结构，绘制了蝾螈端脑整个发育和损伤再生过程中原位单细胞分辨率的基因表达图谱和细胞空间动态变化图谱，为研究脑再生的分子机制奠定了基础。
② 有一种神经干细胞（ependymoglial cells，EGCs）亚型在蝾螈端脑再生过程中早期被激活，在再生中后期进行大量增殖，而其他EGCs保持休眠状态，推测此EGCs亚型是参与伤口愈合反应的主要细胞群，并转化为损伤缺失的神经元（lost neurons）。
③ 再生和发育两个生物学过程的细胞空间分布和分子途径特征极其相似，表明蝾螈的脑再生可能通过具有相似的机制分子调控干/祖细胞的分化，部分再现脑发育过程中的神经发生。
① 利用基于Smart-seq2的snRNA-seq和基于液滴的DNBelab C4 RNA-seq，结合Stereo-seq，研究成年食蟹猴的前额叶皮层、初级运动皮层和初级视觉皮层，在单细胞空间分辨率下建立了一个非灵长类脑皮层的转录组和染色质可及性图谱（）。
② 通过大规模的平行和整合图谱分析，在空间上定义了细胞类型特异性和区域特异性的调节元件，并确定了兴奋性神经元在区域异质性中的转录调控。
③ 基于单核转录组和染色质可及性综合分析，识别出少突胶质细胞成熟的主调控因子，为脱髓鞘疾病的进一步功能研究提供了候选点，并证明了成年人类和猕猴大脑中少突胶质细胞轨迹的保守调控景观。
④ 结合表观遗传学和空间转录组分析，证实了猕猴皮质细胞类型中人类神经系统疾病（如重度抑郁症、精神分裂症、阿尔兹海默症）危险因素的细胞类型的特异性富集。（Lina）
① 基于Stereo-seq，成功建立了非模式作物花生的高分辨率空间转录图谱，并通过与其他3个组织（根、茎和下胚轴）作比较，揭示了peg的复杂细胞类型特异性和空间基因表达特征。
② 在Stereo-seq的基础上，改进了冷冻装置和透化方法：将厚度为10 μm的冷冻截面安装在为植物组织设计的100 mm2 Stereo-seq芯片上；在透化方法中，将溶液用超声雾化器喷洒在截面表面上，以避免mRNA溶液的横向扩散。
③ 从根、下胚轴、茎和pegs中依次鉴定出35,970、47,304、47,096和44,825个基因，在BIN80处将所有数据可视化为18个簇，并发现peg中仅在维管束区域的细胞类型与根和茎中的维管束区域相似，表明peg是一种与茎和根均有较大差异的组织。
④ peg尖端的表皮中富集参与糖苷和皂苷合成的基因，用来保护peg尖端的胚珠不受地下害虫的侵害；peg中后部表皮中富集感知环境信号的基因，用来感知土壤刺激并在地下启动胚胎和果实发育。（寒鹤）
研究文章；花生，peg，细胞异质性，Stereo-seq，空间转录组；Yiyang Liu，Guoxin Xu，Shubo Wan，Guowei Li；山东农业科学院作物种质资源研究所，深圳华大生命科学研究院，山东农业科学院湿地农业与生态学研究所；中国
① 利用Stereo-seq对出生后第七天（P7）的小鼠脑样本矢状面最中线张切片进行实验，验证了已报道25个脑区特异性基因分布与报道结果一致，并且2张切片之间具备极高的一致性，bin50（50×50 DNB bins，25 µm diameter）基因数为2,276，证明了Stereo-seq原位捕获的高精度和高效性，为后续数据探索和生物学解释提供了高质量的资源。
② 采用Bin50对P7小鼠脑矢状面切片聚类，共鉴定出41个不同的解剖学结构，且已知典型标识基因在脑切片上的表达分布和报道的原位杂交数据相同；同时，在脑切片上观察到了皮层不同层、背腹轴以及不同脑区的基因和调节子表现出强烈的区域特异性，表明了不同脑区的功能差异。
③ 通过Stereo-seq，基于图像的细胞分割描述了全脑切片的单细胞分辨率图谱；在P7小鼠脑切片的不一样的区域识别出了41个亚型的99,365个细胞（每个细胞698个基因），不同细胞类型其空间分布表现出强烈的区域异质性，表明每个区域都有特定的功能。（蓉宝）
① 从雌性成年小鼠的肺中收集4个连续的10 μm厚度的冷冻切片，分别用于H&E染色（n=1）和Stereo-seq实验（n=3），构建高分辨率的发育中雌性小鼠肺空间转录组（spatial transcriptome，ST）图谱，表征肺不同功能区的基因表达模式及近端至远端轴的功能梯度，同时整合ST与scRNA-seq数据，有助于深入研究肺发育生物学和疾病机理等。
② 对切片进行质量评估，每个切片获得4.77 GB reads，并进一步处理得到bin1矩阵，基于合并后的bin 50（25 μm）构建雌性成年小鼠肺部的ST图谱。
③ 分析细支气管、肺泡和免疫细胞等标记基因的空间分布，利用Hotspot软件探究空间共表达基因得到17个细胞亚群，并定义出细支气管、肺泡、软骨和免疫细胞等肺特定结构或细胞类型。
④ 通过远端和近端肺的差异表达基因及功能富集，发现Malat1、Jarid2、Lars2等在肺远端表达较高，Scgb1a1、Scgb3s2、Cyp2f2等在肺近端表达较高，并表征了远、近端的功能差异梯度。
⑤ 整合ST和已发表scRNA-seq数据，确定11种主要的细胞类型并计算了细胞类型空间分布的相关性；通过基因调控网络重建表征99个在肺切片中有明显空间分布的调控因子，确定了细胞类型特异性的调控模块。
① 对多种小鼠皮肤黑色素瘤模型进行scRNA-seq和空间转录组测序，通过谱系追踪和定量建模，生成了一个关于黑色素瘤细胞状态的多样性和轨迹的时空分辨率图谱，提出了肿瘤生长的分层模型，并揭示了仅有特定细胞群具有支持肿瘤生长和转移的能力。
② 确定了7种不同的黑色素瘤细胞状态，其中，cluster4和cluster1共同表达去分化神经嵴（neural crest，NC）干细胞样细胞的标记基因，且cluster4还表现出迁移前NC干细胞的特征和最显著的去分化特征。
③ 在C57BL/6小鼠移植模型中，利用谱系追踪实验，提出一个细胞分层模型，即原发黑色素瘤至少包含干细胞样和祖细胞样细胞群体，二者具有不一样的生长动力学和命运决定。
④ 聚类分析空间转录组和scRNA-seq数据，并利用Stereo-seq，发现上皮-间充质转化前（pre-epithelial-mesenchymal transition，pre-EMT）NC干细胞样预测得分与到最近血管的距离负相关；进一步研究之后发现，内皮细胞可促进黑色素瘤细胞去分化的生态位环境的形成，以及pre-EMT NC样干细胞的出现和/或维持，进而刺激黑色素瘤的生长。
⑤ 黑色素细胞黑色素瘤系的SOX10敲低后，PRRX1表达活性增加，引起间充质样细胞重编程；用他莫昔芬（tamoxifen）治疗荷瘤小鼠，并在治疗后30 d收集黑色素瘤病变样本做scRNA-seq，确定了Prrx1标记的是形成肿瘤转移起始的细胞库。（大禹）
Stereo-seq助力揭示腹直肌前鞘下支持hPSC胰岛细胞的高效定植和发挥功能
① 建立了全新的、能有效支持hPSC胰岛细胞的体内存活、功能成熟和功能长期维持的移植方案：腹直肌前鞘下移植，为临床糖尿病治疗提供了理想的胰岛移植新策略，有望实现1型糖尿病的治愈。
② 与肝脏门静脉移植相比，腹直肌前鞘下移植术具有微创、简单、耐受性良好，以及该部位的移植物易于进行活检和成像等优势。
③ 将hPSC胰岛细胞输注到糖尿病模型恒河猴腹直肌前鞘下，所有接受移植的糖尿病恒河猴的总血糖控制均得到了显著改善。
④ 使用Stereo-seq分析原位hPSC胰岛细胞移植物的基因表达，证实了腹直肌前鞘下移植能够长期维持hPSC胰岛细胞的特性和功能。（Lina）
snRNA-seq和Stereo-seq联合分析揭示宫颈鳞状细胞癌的免疫微环境
① 采用snRNA-seq对5名宫颈鳞状细胞癌（cervical squamous cell carcinoma，CSCC）患者的67,003个宫颈组织细胞做多元化的分析，并利用Stereo-seq分析2名非癌症患者和4名CSCC患者的宫颈样本，揭示了CSCC组织的结构和免疫细胞组成，绘制了CSCC的空间免疫细胞图谱，增强了对CSCC免疫微环境的认识，并为晚期CSCC的治疗提供了思路。
② 在snRNA-seq和Stereo-seq数据中评估了具有不一样免疫功能的3个基因组的表达谱，即共刺激、细胞毒性/效应和共抑制/耗竭，发现除LGALS9和IDO1外，CSCC的肿瘤区和炎症区大多数免疫抑制基因的表达水平均不明显高于非癌症样本。
③ CD56+NK细胞和未成熟树突状细胞在高代谢肿瘤区域显示出比低代谢肿瘤区域更强的信号，表明高代谢肿瘤可能更易和先天免疫反应相关；低代谢肿瘤区嗜酸性粒细胞、未成熟B细胞和Treg细胞较多，提示适应性免疫反应无效。
④ 进一步分析snRNA-seq中的成纤维细胞，发现了一组与致瘤性癌相关的肌成纤维细胞（myofifibroblasts，myCAFs），其是CSCC肿瘤微环境的重要组成部分，可能通过抑制淋巴细胞的浸润和肿瘤细胞外基质的重塑来支持肿瘤的生长和转移。（Max）
① 利用Stereo-seq，以50 μm的分辨率分析来自4个错配修复功能完整（proficient-mismatch repair，pMMR）结直肠腺癌样本和2个匹配的远端正常样本，阐明了在病理学注释的癌症区域中不连续炎症反应所涉及的分子模式，可能有助于阐明临床实践中组合免疫治疗的发展。
② 基于空间变化基因表达的位置，揭示了空间变化的免疫生态系统，并确定了预定义的“冷”肿瘤中具有细胞因子分泌增加和MHC-II分子表达上调的“warmed-up”表型；这种“warmed-up”免疫特征与原位拷贝数差异和组织重塑过程有关。
③ “warmed-up”特征基因表明，从TCGA数据库中获得的结直肠癌患者的总存活率有所提高。（Lina）
Spatial-ID：通过迁移学习和空间嵌入进行空间高分辨转录组数据的细胞注释
② 该方法有效整合了现有的参考scRNA-seq数据的知识和SRT数据的空间信息，大幅度的提升了细胞类型识别的准确性，且提高了对来自不同测序技术的数据的稳健性。
③ 选用4个具有不一样特征的公开SRT数据集，通过比较根据预测和ground truth计算的准确性和加权F1分数，发现Spatial-ID的性能优于目前最优的细胞注释方法；与DNN的结果相比，确认空间信息在Spatial-ID中发挥重要作用。
④ Spatial-ID对基于3D FISH的SRT数据集（即小鼠下丘脑视前区）的分析，显示出其更好的性能，进一步证实该办法能够有效地应用于3D SRT数据集的细胞类型注释；基于FISH的SRT数据集（即小鼠初级运动皮层）的随机基因丢失模拟的比较，证明了Spatial-ID对基因丢失变化的较好稳健性。
⑤ 将Spatial-ID应用于Stereo-seq获取的小鼠端脑数据集，展示了其在构建大视野空间转录组脑图谱中的应用前景。（Lina）
① 开发了一种图自监督对比学习方法GraphST，该方法充分的利用空间信息和基因表达谱进行空间信息聚类、批处理集成和细胞类型反卷积。
② GraphST首先将图神经网络与基于增强的自监督对比学习相结合，通过编码基因表达和空间邻近性来学习用于空间聚类的spots的表示；然后通过训练一个自动编码器，以无监督的方式从scRNA-seq数据中学习信息丰富的细胞特征；最后，利用映射矩阵来推断空间转录组spots的细胞类型组成。
③ 将GraphST应用于人类和小鼠组织的不同Visium、Stereo-seq和Slide-seqV2数据集（人脑、乳腺癌组织和淋巴结；小鼠乳腺癌、嗅球、大脑和胚胎），发现其在识别空间域方面优于现有的7种方法（如Seurat、Giotto等），并能有效去除批次效应，而无需明确检测批次因素。
④ 通过GraphST将scRNA-seq数据投射到空间转录组上以预测空间spots中的细胞状态（细胞类型和样本类型），与cell2location（性能最好的反卷积方法）相比，其计算出的cell-to-spot映射矩阵比可以更准确地推断细胞类型组成。
⑤ GraphST可以将scRNA-seq衍生的样本表型转移到空间转录组上，这一点通过描绘肿瘤来源的组织切片中肿瘤和正常相邻区域得到了证明。（Lina）
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